К дифференциально диагностическим питательным средам относятся. Питательные среды дифференциально-диагностическая. Функции нормальной микрофлоры

Классификация питательных сред производится по их составу и назначению

1.По составу питательные среды делятся на простые и сложные

Различают группу сред общего назначения - простых. К этой группе относят мясо-пептонный бульон (простой питательный бульон), мясо-пептонный агар {простой питательный агар), питательный желатин. Эти среды применяются для выращивания многих патогенных микробов. Среды общего назначения, или простые питательные среды, готовятся обычно из гидролизатов с добавлением пептона и хлористого натрия. Их используют также как основу для приготовления сложных сред.

Также по составу выделяют белковые, безбелковые и минеральные среды. 2. По происхождению среды разделяют на искусственные и естественные (природные ).

Естественные питательные среды могут содержать компоненты животного (например, кровь, сыворотка, жёлчь) или растительного (например, кусочки овощей и фруктов) происхождения.

3.По назначению выделяют консервирующие среды (для первичного посева и транспортировки), среды обогащения (для накопления определённой группы бактерий), среды для культивирования {универсальные простые, сложные специальные и для токсинообразования), среды для выделения и накопления (консервирующие, обогащения и элективные) и среды для идентификации (дифференциальные и элективно-дифференциальные).

Консервирующие питательные среды предупреждают отмирание патогенов и подавляют рост сапрофитов. Наибольшее применение нашли глицериновая смесь, гипертонический раствор, глицериновый консервант с LiCl 2 , раствор цитрата натрия и дезоксихолата натрия.

Среды обогащения для бактерий

Среды обогащения (например, среда Китта-Тароцци, селенитовый бульон, тиогликолевая среда) применяют для накопления определённой группы бактерий за счёт создания условий, оптимальных для одних видов и неблагоприятных для других. Наиболее часто в качестве подобных агентов используют различные красители и химические вещества - соли жёлчных кислот, тетратионат Na+, теллурит К, антибиотики, фуксин, генциановый фиолетовый, бриллиантовый зелёный и др.

Также по назначению различают среды элективные, специальные и дифференциально-диагностические.

Среды элективные (селективные, избирательные, накопления, обогащения). Принцип создания элективных питательных сред основан на удовлетворении основных биохимических и энергетических потребностей того вида микроба, для культивирования которого они предназначены, или на добавление ингибиторов, подавляющих рост сопутствующей микрофлоры. Определенный состав и концентрация питательных веществ, микроэлементов, ростовых факторов при строго определённом значении pH или добавлении ингибиторов обеспечивают оптимальные условия для выращивания одного или нескольких видов микроорганизмов. При посеве на них материала, содержащего смесь различных микробов, раньше всего будет проявляться рост того вида, для которого среда будет элективной. Примером элективных сред являются желчный бульон, селенитовый бульон, среда Плоскирева – для выращивания микробов семейства кишечных, щелочная пептонная вода – для холерного вибриона.

Желчный бульон . К МПБ добавляют 10-20% бычьей желчи. Желчь подавляет рост коков и воздушной флоры, но благоприятна для размножения сальмонелл.

Селенитовый бульон . Состоит из фосфатного бульона с добавлением натриевой соли селенита, которая является ингибитором роста кокковой флоры, кишечной палочки, но не задерживает роста сальмонелл.

Среда Плоскирева . Плотная среда, содержащая ингибиторы кишечной палочки, коков, но благоприятная для роста шигелл и сальмонелл, размножение которых не тормозится бриллиантовым зелёным и желчными солями.

Пептонная вода . Содержит 1% пептона и 0,5% хлористого натрия. Среда является элективной для холерных вибрионов, т.к. они лучше других бактерий размножаются на “голодных средах”, особенно при щелочной реакции, потому что сами выделяют кислые продукты жизнедеятельности.

Специальные среды. Необходимы для культивирования бактерий, не растущих на простых питательных средах. Для некоторых организмов к простым питательным средам необходимо добавлять углеводы, кровь и др. дополнительные питательные вещества. Примерами простых питательных сред являются сахарный бульон и сахарный агар для стрептококка (готовится соответственно из МПБ и МПА, к которым добавляется 0,5-2% глюкозы).

Для пневмококков и менингококков специальной средой являются сывороточный бульон и сывороточный агар (для приготовления сывороточного бульона смешивают 1 часть МПБ с 2 частями свежей сыворотки, для получения, сывороточного агара к расплавленному МПА добавляется 10-25% стерильной лошадиной или бычьей сыворотки).

Дифференциально-диагностические среды используют для определения видовой принадлежности исследуемого микроба, основываясь на особенностях его обмена веществ. По своему назначению дифференциально-диагностические среды разделяют следующим образом:

1. Среды для выявления протеолитической способности микробов, содержащие в своем составе молоко, желатин, кровь и т.д.

2. Среды с углеводами и многоатомными спиртами для

обнаружения различных сахаролитических ферментов.

В состав дифференциально-диагностических сред, предназначенных для выявления сахаролитических свойств и окислительно-восстановительных ферментов, вводят индикаторы: нейтральную красную, кислый фуксин, бромтимоловый синий, водный голубой с розоловой кислотой (ВР). Изменяя свою окраску при различных значениях рН, индикатор указывает на наличие фермента и расщепление введённого в среду ингредиента.

Примеры дифференциально-диагностических сред:

Среда Эндо . Состоит из МПА с добавлением 1% лактозы и обесцвеченного сульфитом натрия основного фуксина (индикатор). Среда Эндо имеет слаборозовый цвет. Используется в диагностике кишечных инфекций для дифференциации бактерий, разлагающих лактозу с образованием кислых продуктов, от бактерий, не обладающих этой способностью. Колонии лактозопозитивных микробов (кишечная палочка) имеют красный цвет вследствие восстановления фуксина. Колонии лактозонегативных микроорганизмов - сальмонелл, шигелл и др. -бесцветны.

К дифференциально-диагностическим средам относятся короткий и развёрнутый пёстрый ряд . Он состоит из сред с углеводами (среды Гисса), МПБ, молока, мясопептонной желатины.

Среды Гисса готовятся на основе пептонной воды, к которой прибавляются химически чистые моно-, ди- или полисахариды (глюкоза, лактоза, крахмал и др.).

Для обнаружения сдвигов рН в результате образования кислот и разложения углевода в среды прибавляют индикатор. При более глубоком расщеплении углеводов образуются газообразные продукты (СО 2 , СН 4 и др.), которые улавливаются при помощи поплавков - маленьких пробирочек, опущенных в среду кверху дном. Среды с углеводами могут готовиться и плотными – с добавлением 0,5-1% агар-агара. Тогда газообразование улавливается по образованию пузырьков (разрывов) в столбике среды.

На МПБ, входящем в пёстрый ряд, обнаруживают продукты, образующиеся при расщеплении аминокислот и пептонов (индол, сероводород). Сероводород обнаруживается путем помещения в МПБ после засева культуры полоски фильтровальной бумаги, пропитанной раствором уксуснокислого свинца. При расщеплении аминокислот, содержащих серу, выделяется сероводород, бумажка чернеет за счёт образования сернистого свинца. Для определения индола можно использовать сложный индикатор. Индол образуется при расщеплении триптофана, и его можно обнаружить при добавлении к культуре, выращенной на МПБ, этого индикатора. При наличии индола МПБ окрашивается в зеленый или синий цвет.

В практических бактериологических лабораториях широко применяют микро- и экспресс-методы для ориентировочного изучения биохимических свойств микроорганизмов. Для этой цели существует множество тест-систем. Наиболее часто используют систему индикаторных бумаг (СИБ). СИБы представляют из себя диски фильтровальной бумаги, пропитанные растворами сахаров или других субстратов в сочетании с индикаторами. Такие диски опускают в пробирку с выросшей в жидкой питательной среде культурой. По изменению цвета диска с субстратом судят о работе фермента. Микро-тест системы для изучения идентификации энтеробактерий представлены одноразовыми пластиковыми контейнерами со средами, содержащими различные субстраты, с добавлением индикаторов. Посев чистой культуры микроорганизмов в такие тест-системы позволяет быстро выявить способность бактерий утилизировать цитраты, глюкозу, сахарозу, выделять аммиак, индол, разлагать мочевину, лизин, фенилаланин и т.д.

Питательный агар, а также основные дифференциально-диагностические среды выпускаются в настоящее время в виде сухих препаратов, содержащих все необходимые составные части. К таким порошкам нужно добавить только воду и сварить, а затем, после разливки, простерилизовать.

Питательной средой в микробиологии называют среды, содер­жащие различные соединения сложного или простого состава, которые применяются для размножения бактерий или других микроорганизмов в лабораторных или промышленных условиях.

Питательные среды готовят из продуктов животного или рас­тительного происхождения. Большое значение имеет наличие в питательной среде ростовых факторов, которые катализируют метаболические процессы микробной клетки (витамины груп­пы В, никотиновая кислота и др.).

Искусственные среды готовят по определенным рецептам из различных настоев или отваров животного или растительного про­исхождения с добавлением неорганических солей, угле­водов и азотистых веществ.

В бактериологической практике чаще всего используют сухие питательные среды, которые получают на основе достижений современной биотехнологии. Для их приготовления используют экономически рентабельное непищевое сырье: утратившие срок годности кровезаменители (гидролизин-кислотный гидролизат крови животных, аминопептид - ферментативный гидролизат крови; продукты биотехнологии (кормовые дрожжи, кормовой лизин, виноградная мука, белколизин). Сухие питательные среды могут храниться в течение длительного времени, удобны при транспортировке и имеют относительно стандартный состав.

По консистенции питательные среды могут быть жид­кими, полужидкими, плотными. Плотные среды готовят путем до­бавления к жидкой среде 1,5-2% агара, полужидкие - 0,3- 0,7 % агара. Агар представляет собой продукт переработки осо­бого вида морских водорослей, он плавится при температуре 80-86 °С, затвердевает при температуре около 40 °С и в застыв­шем состоянии придает среде плотность. В некоторых случаях для получения плотных питательных сред используют желатин (10-15%). Ряд естественных питательных сред (свернутая сы­воротка крови, свернутый яичный белок) сами по себе являются плотными.

По целевому назначению среды подразделяют на основные, элективные и дифференци­ально-диагностические.

К основным относятся среды, применяемые для выращивания многих бактерий. Это триптические гидролизаты мясных, рыбных продуктов, крови животных или казеина, из которых готовят жидкую среду - питательный бульон и плотную - пита­тельный агар. Такие среды служат основой для приготов­ления сложных питательных сред - сахарных, кровяных и др., удовлетворяющих пищевые потребности патогенных бак­терий.

Элективные питательные среды предназначены для избира­тельного выделения и накопления микроорганизмов определен­ного вида (или определенной группы) из материалов, содержа­щих разнообразную постороннюю микрофлору. При создании элективных питательных сред исходят из биологических особен­ностей, которые отличают данные микроорганизмы от большин­ства других. Например, избирательный рост стафилококков на­блюдается при повышенной концентрации хлорида натрия, хо­лерного вибриона - в щелочной среде и т. д.

Дифференциально-диагностические питательные среды при­меняются для разграничения отдельных видов (или групп) мик­роорганизмов. Принцип построения этих сред основан на том, что разные виды бактерий различаются между собой по биохи­мической активности вследствие неодинакового набора фермен­тов.

Особую группу составляют синтетические и полусинтетиче­ские питательные среды . В состав синтетических сред входят химически чистые вещества: аминокислоты, минеральные соли, углеводы, витамины. В полусинтетические среды дополнительно включают пептон, дрожжевой экстракт и другие питательные вещества. Эти среды чаще всего применяют в научно-исследова­тельской работе и в микробиологической промышленности при получении антибиотиков, вакцин и других препаратов.

В последние годы в целях экономии питательных сред и уско­ренной идентификации некоторых микроорганизмов (энтеробактерии, стафилококки, стрептококки и др.) применяются так на­зываемые микротест-системы(МТС). Они представляют собой полистироловые пластины с лунками, в которых содержатся сте­рильные дифференциально-диагностические среды. Стерилизацию МТС проводят УФ-облучением. Микротест-системы особенно удобны при массовых бактериологических исследованиях в практических лабораториях.

Вопрос №9. Принципы и методы выделения чистых культур бакте­рий. Характер роста микроорганизмов на жидких и плотных питательных средах.

Чистой культурой называется популяция бактерий од­ного вида или одной разновидности, выращенная на питательной среде. Многие виды бактерий подразделяют по одному признаку на биологические варианты - биовары . Биовары, различающие­ся по биохимическим свойствам, называют хемоварами , по анти­генным свойствам - сероварами , по чувствительности к фагу - фаговарами . Культуры микроорганизмов одного и того же вида, или биовара, выделенные из различных источников или в разное время из одного и того же источника, называют штаммами , которые обычно обозначаются номерами или какими-либо сим­волами. Чистые культуры бактерий в диагностических бактерио­логических лабораториях получают из изолированных колоний, пересевая их петлей в пробирки с твердыми или, реже, жидкими питательными средами.

Колония представляет собой видимое изолированное скоп­ление особей одного вида микроорганизмов, образующееся в результате размножения одной бактериальной клетки на плотной питательной среде (на поверхности или в глубине ее). Колонии бактерий разных видов отличаются друг от друга по своей мор­фологии, цвету и другим признакам.

Чистую культуру бактерий получают для проведения диагно­стических исследований - идентификации, которая достигается путем определения морфологических, культуральных, биохимиче­ских и других признаков микроорганизма.

Морфологические и тинкториальные признаки бактерий изучают при микроскопическом исследовании мазков, окрашенных разными методами, и нативных препаратов.

Культуральные свойства характеризуются питатель­ными потребностями, условиями и типом роста бактерий на плот­ных и жидких питательных средах. Они устанавливаются по мор­фологии колоний и особенностям роста культуры.

Биохимические признаки бактерий определяются на­бором конститутивных и индуцибельных ферментов, присущих определенному роду, виду, варианту. В бактериологической прак­тике таксономическое значение имеют чаще всего сахаролитические и протеолитические ферменты бактерий, которые определя­ют на дифференциально-диагностических средах.

При идентификации бактерий до рода и вида обращают вни­мание на пигменты, окрашивающие колонии и культуральную среду в разнообразные цвета. Например, красный пигмент обра­зуют Serratia marcescens, золотистый пигмент - Staphylococcus aureus (золотистый стафилококк), сине-зеленый пигмент - Pseu-domonas aeruginosa.

Для установления биовара (хемовара, серовара, фаготипа) проводят дополнительные исследования по выялвениб соответствующего маркера – определению фермента, антигена, чувствительности к Фанам.

Методы выделения чистых культур бакте­рий.

Универсальным инструментом для производства посевов явля­ется бактериальная петля. Кроме нее, для посева уколом при­меняют специальную бактериальную иглу, а для посевов на чашках Петри - металлические или стеклянные шпатели. Для посевов жидких материалов наряду с петлей используют пасте­ровские и градуированные пипетки. Первые предварительно из­готовляют из стерильных легкоплавких стеклянных трубочек, которые вытягивают на пламени в виде капилляров. Конец ка­пилляра сразу же запаивают для сохранения стерильности. У пастеровских и градуированных пипеток широкий конец за­крывают ватой, после чего их помещают в специальные пеналы или обертывают бумагой и стерилизуют.

При пересеве бактериальной культуры берут пробирку в левую руку, а правой, обхватив ватную пробку IV и V пальцами, вынимают ее, пронося над пламенем горелки. Удерживая дру­гими пальцами той же руки петлю, набирают ею посевной ма­териал, после чего закрывают пробирку пробкой. Затем в пробирку со скошенным агаром вносят петлю с посевным материалом, опуская ее до конденсата в нижней ча­сти среды, и зигзагообразным движением распределяют мате риал по скошенной поверхности агара. Вынув петлю, обжигают край пробирки и закрывают ее пробкой. Петлю стерилизуют в пламени горелки и ставят в штатив. Пробирки с посевами над г писывают, указывая дату посева и характер посевного мате­риала (номер исследования или название культуры).

Посевы «газоном» производят шпателем на питательный агар в чашке Петри. Для этого, приоткрыв левой рукой крышку, пет­лей или пипеткой наносят посевной материал на поверхность питательного агара. Затем проводят шпатель через пламя горел­ки, остужают его о внутреннюю сторону крышки и растирают материал по всей поверхности среды. После инкубации посева появляется равномерный сплошной рост бактерий.

Характер роста микроорганизмов на жидких питательных средах:

Бактерии, засеянные в определенный, но не изменяющийся объем жидкой питательной среды, размножаясь, потребляют питательные элементы, что в дальнейшем приводит к истощению питательной среды и прекращению роста бактерий. Культивирование бактерий в такой системе называют периодическим, а культуру – периодической. Если же условия культивирования поддерживаются путем непрерывной подачи свежей питательной среды и оттока такого же объема культуральной жидкости, то такое культивирование называется непрерывным, а культура – непрерывной.

При выращивании бактерий на жидкой питательной среде наблюдается придонный, диффузной или поверхностный (в виде пленки) рост культуры.

Характер роста микроорганизмов на плотных питательных средах:

Бактерии, растущие на плотных питательных средах, образуют изолированные колонии округлой формы с ровными или неровными краями различной консистенции и цвета, зависящего от пигмента бактерий.

Пигмент, растворимые в воде, диффундируют в питательную среду и окрашивают ее, например синегнойная палочка (Pseudomonas aeruginosa) окрашивает среду в синий цвет. Другая группа пигментов нерастворима в воде, но растворима в органических растворителях. Так, колонии «чудесной палочки» имеют кроваво – красный пигмент, растворимый в спирте. И, наконец, существуют пигменты, нерастворимые ни в воде, ни в органических соединениях.

Вид, форму, цвет и другие особенности колоний на плотной питательной среде (культуральные свойства) учитывают при идентификации бактерий, а также отборе колоний для получения чистых культур.

В промышленных условиях при получении биомассы микроорганизмов с целью приготовления антибиотиков, вакцин, диагностических препаратов и эубиотиков культивирование в основном осуществляют в ферментерах при строгом соблюдении оптимальных параметров для роста и размножения культур.

Вопрос №10. Способы получения энергии бактериями (дыхание, броже­ние). Типы дыхания бактерий.

Дыхание, или биологическое окисление , основано на окисли­тельно-восстановительных реакциях, идущих с образованием АТФ-универсального аккумулятора химической энергии. Энергия необходима микробной клетке для ее жизнедеятельности. При дыхании происходят процессы окисления и восстановления: окисление - отдача донорами (молекулами или атомами) во­дорода или электронов; восстановление - присоединение водо­рода или электронов к акцептору. Акцептором водорода или электронов может быть молекулярный кислород (такое дыхание называется аэробным) или нитрат, сульфат, фумарат (такое дыхание называется анаэробным - нитратным, сульфатным, фумаратным).

Анаэробиоз (от греч. аег - воздух + bios - жизнь) - жизнедеятельность, протекающая при отсутствии сво­бодного кислорода. Если донорами и акцепторами водорода яв­ляются органические соединения, то такой процесс называется брожением . При брожении происходит ферментативное расщепление органических соединений, преимущественно углеводов, в анаэробных условиях. С учетом конечного продукта расщепления углеводов различают спиртовое, молочнокислое, уксуснокислое и другие виды брожения.

По отношению к молекулярному кислороду бактерии можно разделить на три основные группы: облигатные, т.е. обязатель­ные, аэробы, облигатные анаэробы и факультативные анаэробы.

Типы дыхания бактерий:

· Строгие аэробы. Функционируют в присутствие О 2

· Микроаэрофилы. Нуждаются в О 2 в меньшей степени.

· Факультативные анаэробы. Живут в присутствии О 2 и без негою могут дышать кислородными носителями: сульфаты, карбонаты.

· Облигатные анаэробы. Бактерии, которые бродят. Для них О 2 ядовит.

· Культура – микроорганизмы, выросшие на питательной среде.

· Колония – скопление микробных клеток.

· Чистая культура – микробы одного вида.

· Клон – генетически однородная популяция м/о, выделенная из одной микробной клетки при ее прямой изоляции.

· Штамм – чистая культура микробов выделенная из определенного источника в определенное время.

1.1. Среды Эндо, Левина, Плоскирева . Используют как дифференциально-диагностические элективные среды для культивирования бактерий кишечной группы (содержит лактозу). Микроорганизмы, ферментирующие находящийся в этих средах молочный сахар (лактозу), образуют окрашенные колонии - лактозоположительные (колонии красного цвета с металлическим блеском или без блеска). Колонии микробов, не ферментирующие лактозу, бесцветные - лактозонегативные – нежно-розовые, прозрачные, пропускающие свет.

К 100 мл МПА (рН 7,6) при температуре 70°С стерильно добавляют 5 мл 20% раствора лактозы и смесь 0,5 мл насыщенного раствора основного фуксина с 1,25 мл свежеприготовленного раствора сульфата натрия.

1.2. Среды с крахмалом используют для выявления микроорганизмов, образующих амилазу. Наличие фермента определяется при добавлении к культуре несколько капель раствора Люголя

(цвет среды не изменяется). Нерасщепленный крахмал дает с этим раствором синее окрашивание.

1.3. Молоко. При росте микроорганизмов, сбраживающих лактозу, свертывается.

2. Коммерческие наборы – для изучения биохимических свойств (идентификации микроорганизмов по сахаролитической и протеолитической активности).

2.1. Среды Гисса с углеводами (глюкоза, лактоза, сахароза, арабиноза и другие) в которых выявляют ферментативную активности микроорганизмов.Под действием образующейся при расщеплении углевода кислоты индикатор изменяет окраску среды. Соломенно-желтого цвета среда при положительной реакции меняет цвет на красный или интенсивно розовый, поэтому эти среды названы «пестрый ряд». Микробы, не ферментирующие данный углевод, растут на среде, не изменяя ее цвета. Наличие газа устанавливают по образованию пузырьков в средах с агаром или по скоплению его в «поплавке» на жидких средах.

Состав: пептон - 10 г, хлорид натрия - 5 г, углевод - 10 г, реактив Андреде (фуксин)- 10 мл, вода дистиллированная до 1000 мл, рН после стерилизации 7,2-7,4.

2.2. Среды для изучения протеолитических свойств

Среды с желатином . В некоторых бактериях (холерный вибрион, стафилококк, сибиреязвенная палочка и т. д.) протеолитические ферменты выявля­ются путем разжижения желатины.

Среды с молоком. Микроорганизмы, расщепляющие казеин (молочный белок), вызывают пептонизацию молока - оно приобретает вид молочной сыворотки.

Среды с пептоном. При расщеплении пептонов могут выделяться индол, сероводород, аммиак. Их образования определяют с помощью индикаторных бумажек. Фильтровальную бумагу заранее пропитывают определенными растворами, высушивают, нарезают полосками и, после посева культуры на МПБ, помещают под пробку между нею и стенкой пробирки. После инкубации в термостате учитывают результат. Аммиак вызывает посинение лакмусовой бумажки; при выделении сероводорода на бумажке, пропитанной раствором, содержащим ацетат свинца, бикарбонат натрия, происходит образование сульфата свинца - бумажка чернеет; индол вызывает покраснение бумажки, пропитанной горячим насыщенным раствором щавелевой кислоты.

2.3. Микротесты - системы (МТС). Они представляют собой полистироловые пластины с лунками, в которых содержатся стерильные дифференциально-диагностические среды.

2.4. Системы индикаторные бумажные (СИБ) - дифференциально-диагностические среды на фильтровальной бумаге.

Для культивирования и дифференциации анаэробных микроорганизмов: среда Вильсон-Блера . Готовят из мясо-пептонного агара, к которому добавляют глюкозу, Na 2 S0 3 , хлорид железо FeCl 2 . На этой среде возбудитель газовой гангрены образует почернение и разрыв агара. Рост происходит в глубине агара. При этом осуществляется восстановление Na 2 S0 3 в Na 2 S (сульфит натрия), который соединяясь с хлоридом железа, образует сульфат железа черного цвета. Разрыв питательной среды связан с газообразованием.

к работе № 2

Микроорганизмам, как всему живому, присущи три основные физиологические функции: питание, дыхание и размножение.

Основные понятия темы:

Колония – видимое невооруженным взглядом скопление микробов на плотной питательной среде, выросшее из одной клетки.

Колония - это потомство микробов, выросших из одной клетки. Т.к. все микробы в колонии выросли из одной клетки, они относятся к одному виду, т.е. в каждой изолированной колонии (отдельно стоящей, не сливающейся с другими колониями) содержится чистая культура.

Чистая культура – популяция микроорганизмов, состоящая из особей одного вида.

Индикация – обнаружение возбудителя в исследуемом материале (определение рода)

Идентификация – определение вида, типа, биовара, серовара, фаговара выделенной чистой культуры.

к работе № 3

Дыхание микроорганизмов – биологическое окисление субстрата с выделением необходимой для метаболизма энергии. По типу дыхания микроорганизмы делятся на 3 основные группы: аэробы могут жить только в присутствии кислорода (холерный вибрион); факультативные анаэробы могут жить при любом процентном содержании кислорода и без него (кишечная палочка); анаэробы (облигатные) – только в отсутствие кислорода (возбудители газовой гангрены). При культивировании облигатных анаэробов требуется создание особых условий анаэробиоза . При этом используют особые приборы и среды (анаэростат, эксикатор, среды тиогликолиевая, Вильсона-Блера).

Исследования бактерий требуют скрупулезной работы с многочисленным оборудованием и инструментарием. Чтобы микроорганизмы в лабораторных условиях максимально быстро размножались и могли поддерживать нормальную жизнедеятельность, используются специальные среды питательные. Их состав и биофизические условия подходят для активного роста бактериальной культуры.

Питательные среды. Микробиология и другие области применения

Колонии бактерий в лабораторных условиях выращиваются на чашках Петри, которые заполнены желеобразным или полужидким содержимым. Это и есть среды питательные, состав и свойства которых максимально приближены к естественным для качественного роста культуры.

Например, такая элективная среда пригодна только для размножения кишечной палочки. Тогда из посева множества бактерий на чашке Петри мы увидим только колонии той самой кишечной палочки и никакие больше. Прежде чем приступать к работе, необходимо хорошо знать метаболизм исследуемой бактерии, чтобы удачно ее отобрать из смеси других видов.

Твердые, полужидкие и жидкие питательные среды

Бактерии могут выращиваться не только на твердых субстратах. Среды питательные отличаются между собой по агрегатному состоянию, что зависит от состава при изготовлении. Изначально все они имеют жидкую консистенцию, а при добавлении желатина или агара в определенном процентном соотношении смесь застывает.

Жидкие питательные среды обычно находятся в пробирках. Если появляется необходимость выращивать бактерии в таких условиях, добавляют раствор с пробой культуры и ждут 2-3 суток. Результат может быть различным: выпадает осадок, появляется пленка, плавают мелкие хлопья или образуется мутный раствор.

Плотная питательная среда часто используется в микробиологическом исследовании для изучения свойств колоний бактерий. Такие среды всегда прозрачные или полупрозрачные, чтобы была возможность правильно определить цвет и форму культуры микроорганизмов.

Приготовление питательных сред

Очень просто готовятся такие субстраты, как мясопептонные смеси на основе бульона, желатина или агара. Если нужно сделать твердый или полужидкий субстрат, в жидкость добавляют соответственно 2-3% или 0,2-0,3% желатина или агара. Они играют главную роль в затвердевании смеси, но никак не являются источником питательных веществ. Таким образом, и получают среды питательные, которые пригодны для роста бактериальной культуры.

Для отличия одних видов бактерий от других на основании их ферментативной активности применяются дифференциально-диагностические среды . Например, среды Гисса, среда Эндо, среда Левина, среда Плоскирева, среда Олькеницкого. Среды Эндо, Левина, Плоскирева в чашках Петри применяются для дифференцировки бактерий кишечной группы по способности сбраживать лактозу. Эти среды содержат питательный агар, лактозу и индикатор, изменяющий свой цвет в кислой среде (индикатор рН). Если посеять на такую среду бактерии, которые сбраживают лактозу, например, кишечную палочку, то в результате сбражи­вания лактозы образуется кислота, и индикатор изменит свой цвет в кислой среде. Поэтому колонии кишечной палочки на таких сре­дах будут окрашены соответственно цвету индикатора: на среде Эндо и среде Плоскирева - в красный цвет, на среде Левина - в черно-синий. Если же на эти среды посеять бактерии, которые не сбраживают лактозу, например, палочки брюшного тифа или па­лочки дизентерии, то кислота не образуется, реакция среды ос­танется слабощелочной и цвет индикатора не изменится. Поэто­му колонии бактерий, не сбраживающих лактозу, на этих средах будут бесцветными. Среду Плоскирева можно отнести также и к элективным средам для выделения палочек дизентерии, так как эта среда содержит соли желчных кислот, задерживающих рост кишечной палочки, и краситель бриллиантовый зеленый, задер­живающий рост воздушной кокковой микрофлоры. Висмут-сульфит агар - это дифференциально-диагностическая среда, при­меняемая главным образом при диагностике сальмонеллезов. При росте сальмонелл происходит восстановление висмута из его солей и колонии сальмонелл окрашиваются в черный цвет. Диф­ференциально-диагностические среды Гисса («пестрого» ряда) готовятся на основе жидкой среды (пептонной воды) или полу­жидкого мясо-пептонного агара. Содержат какой либо углевод или многоатомный спирт (лактозу, глюкозу, маннит, сахарозу) и индикатор, который меняет свой цвет в кислой среде. В пробир­ку с жидкой средой Гисса помещен стеклянный поплавок. Если на среду Гисса посеять микроб, который сбраживает данный уг­левод с образованием кислоты и газа, то есть до конечных про­дуктов, то среда изменит свой цвет, в полужидкой среде появят­ся пузырьки и разрывы в толще агара, в жидкой среде - пузырек газа в поплавке. При сбраживании углевода только до промежу­точных продуктов (до кислоты) происходит только изменение цвета среды, Применяются также комбинированные среды, содержа­щие не один углевод, а два или три, например, среда Олькеницкого - трехсахарный агар с мочевиной. Одна пробирка среды Олькеницкого заменяет скошенный агар и среды Гисса с лакто­зой, сахарозой и глюкозой. Среда готовится на основе не очень плотного МПА. Содержит лактозу (1%), сахарозу (1%), глюкозу (0,1 %), мочевину, соль Мора (сульфат железа), гипосульфит на­трия и индикатор. Среду после стерилизации в расправленном виде наливают в пробирку так, чтобы получился столбик и ско­шенная часть. Посев производится штрихом по скошенной части и уколом в столбик. При сбраживании углеводов, которые содер­жатся в большем количестве (лактозы, сахарозы или обоих сахаров), изменяется цвет всей среды; при сбраживании только глю­козы изменяется цвет столбика, а скошенная часть остается без изменений. Образование газа определяется по наличию пузырь­ков в столбике агара. Культуры, расщепляющие мочевину с об­разованием аммиака, дают щелочную реакцию. При этом проис­ходит нейтрализация кислоты, образующейся при сбраживании углеводов, и цвет среды не изменяется. Расщепление мочевины свойственно протеям и некоторым кишечным палочкам. Патоген­ные энтеробактерии не разлагают мочевину. Добавление соли Мора и гипосульфита позволяет также изучить способность бак­терий к образованию сероводорода по почернению в столбике агара в результате превращения сульфата железа в сульфид чер­ного цвета.

Для экспресс-метода определения ферментативной актив­ности микроорганизмов применяются микротестсистемы и сис­тема индикаторных бумажек (СИБ). Микротестсистема представ­ляет собой контейнер из прозрачного полистирола, состоящий из нескольких ячеек. Ячейки содержат высушенные пит среды с углеводами и индикаторами рн. В каждую ячейку засе­вают взвесь культуры бактерий определенной густоты. В контроль­ные ячейки наливают физ. раствор. Результат учитывают после 3-4-часовой инкубации в термостате по изменению цвета инди­катора.Системы индикаторных бумажек (СИБ) для идентификации семейства энтеробактерии представляют собой диски или полоски хроматографической бумаги, покрытой защитной плен­кой из поливинилового спирта и содержащей определенный суб­страт и индикатор. В пробирке с физиологическим или буферным раствором вносят полную петлю исследуемой культуры или каплю густой микробной взвеси, затем обожженным пинцетом помещают в диски. В контрольные пробирки культуру бактерий не вносят. Результат учитывают по изменению цвета индикатора. Для определения сероводорода диск помещают в пробирку на поверхность МПА, засеянного уколом, что позволяет одновремен­но определить подвижность. Во всех пробирках учитывают пред­варительный результат в тот же день и окончательный - через восемнадцать - двадцать четыре часа. Оксидазная активность определяется путем растирания культуры на индикаторной бу­мажке через 30-60 секунд.

Выделение чистых культур аэробных и анаэробных бактерий. Перечислите принципы и методы получения изолированных колоний аэробов. Методы выделения чистых культур анаэробов. Описать по дням метод Вейнберга.

Культивирование и выделение чистых культур аэробных бактерий

Для культивирования микроорганизмов необходимы определенные условия: температура, аэробные или анаэробные условия.

Температура должна быть оптимальной для данного вида. Боль­шинство патогенных бактерий размножаются при 37°С. Однако для некоторых видов оптимальной является более низкая температура, что связано с особенностями их экологии. Так, для палочки чумы, ес­тественным местом обитания которой являются грызуны в период зимней спячки, оптимум температуры составляет 28°С, как и для лептоспир, для палочки ботулизма - 28°С-35°С.

Кроме оптимальной температуры, для культивирования микроор­ганизмов, в зависимости от вида, необходима аэробность или анаэробность среды.

Для того, чтобы изучить морфологию, Культуральные, биохими­ческие и другие свойства микробов, необходимо получить чистую куль­туру. Обычно культурой микробов называют скопление их на пи­тательной среде в виде помутнения, придонного (пристеночного) рос­та или пленки на поверхности жидкой среды или колоний на плотной среде. Отдельная колония образуется из одной микробной клетки. Чи­стая культура - это культура микробов одного вида, полученная из од­ной колонии. В лабораториях для различных исследований применя­ют определенные известные штаммы микробов. Штамм - это чистая культура микробов, полученная из определенного источника, в опре­деленное время, обладающая известными свойствами. Как правило, штаммы микробов обозначают определенным номером. Например, штамм Staphylococcus aureus 209P применяется для определения актив­ности пенициллина.

Выделение чистых культур аэробов занимает, как правило, три дня и производится по следующей схеме:

1-й день - микроскопия мазка из исследуемого материала, ок­рашенного (обычно по Граму) - для предварительного ознакомления с микрофлорой, что может быть полезным в выборе питательной среды для посева. Затем посев материала на поверхность застывшего пита­тельного агара для получения изолированных колоний. Рассев можно произвести по методу Дригальского на три чашки Петри с питательной средой. Каплю материала наносят на первую чашку и распределяют шпателем по всей чашке. Затем этим же шпателем распределяют остав­шуюся на нем культуру на второй чашке и таким же образом - на тре­тьей. Наибольшее количество колоний вырастет на первой чашке, наи­меньшее - на третьей. В зависимости от того, сколько было микробных клеток в исследуемом материале, на одной из чашек вырастут изоли­рованные колонии.

Такого же результата можно достигнуть, произведя рассев на од­ной чашке. Для этого делят чашку на четыре сектора. Исследуемый материал засевают бактериологической петлей штрихами на первом секторе, затем, прокалив и остудив петлю, распределяют посев из пер­вого сектора во второй и таким же образом последовательно в тре­тий и четвертый сектор. Из отдельных микробных клеток после су­точного инкубирования в термостате образуются изолированные колонии.

2-й день - изучение колоний, выросших на чашках, описание их. Колонии могут быть прозрачными, полупрозрачными или непроз­рачными, они имеют различные размеры, округлые правильные или неправильные очертания, выпуклую или плоскую форму, гладкую или шероховатую поверхность, ровные или волнистые, изрезанные края. Они могут быть бесцветными или иметь белый, золотистый, красный, желтый цвет. На основании изучения этих характеристик выросшие колонии разделяются на группы. Затем из исследуемой группы отби­рают изолированную колонию, готовят мазок для микроскопического исследования с целью проверки однородности микробов в колонии. Из этой же колонии производят посев в пробирку со скошенным пита­тельным агаром.

3-й день - проверка чистоты культуры, выросшей на скошенном агаре путем микроскопии мазка. При однородности исследуемых бак­терий выделение чистой культуры можно считать законченным.

Для идентификации выделенных бактерий изучаются культураль-ные признаки, то есть характер роста на жидких и плотных пита­тельных средах. Например, стрептококки на сахарном бульоне образуют придонный и пристеночный осадок, на кровяном агаре - мелкие, точечные колонии; холерный вибрион образует пленку на поверхности щелочной пептонной воды, а на щелочном агаре - прозрачные коло­нии; палочка чумы на питательном агаре образует колонии в виде «кру­жевных платочков» с плотным центром и тонкими волнистыми края­ми, а в жидкой питательной среде - пленку на поверхности, а затем -нити, отходящие от нее в виде «сталактитов».

Культивирование и выделение чистых культур анаэробных бактерий

Для культивирования анаэробов необходимо понизить окисли­тельно-восстановительный потенциал среды, создать анаэробиоз пу­тем удаления кислорода физическими, химическими или биологичес­кими методами.

К физическим методам можно отнести:

1) механическое удаление воздуха с помощью насоса из анаэ-ростата, в котором помещают чашки с посевами. Одновременно мож­но заменить воздух индифферентным газом: азотом, водородом, угле­кислым газом.

2) выращивание в среде, содержащей редуцирующие вещества. Сре­да Китта-Тароцци - это сахарный бульон с кусочками печени или мяса. Глюкоза и кусочки органов обладают редуцирующей способностью. Среду заливают сверху слоем вазелинового масла, чтобы преградить доступ кислорода воздуха.

3) Наиболее простой, но менее надежный способ - выращивание в глубине высокого столбика сахарного агара.

Химические методы заключаются в том, что чашки с посевами ана­эробов ставят в герметически закрытый эксикатор, куда помещают хи­мические вещества, например, пирогаллол и щелочь, реакция между которыми идет с поглощением кислорода.

Биологический метод основан на одновременном выращивании анаэробов и аэробов на плотных питательных средах в чашках Пет­ри, герметически закрытых после посева. Вначале кислород погло­щается растущими аэробами, а затем начинается рост анаэробов.

Выделение чистой культуры анаэробов начинают с накопления анаэробных бактерий путем посева на среду Китта-Тароцци. В даль­нейшем получают изолированные колонии одним из двух способов:

1) посев материала производят путем смешивания с расплавленным теплым сахарным агаром в стеклянных трубках. После застывания ага­ра в глубине его вырастают изолированные колонии, которые извле­кают путем распила трубки и пересевают на среду Китта-Тароцци (спо­соб Вейнберга);

2) посев материала производят на чашки с питательной средой и инкубируют в анаэростате. Выросшие на чашке изолированные ко­лонии пересевают на среду Китта-Тароцци (способ Цейсслера).